เดือนมิถุนายน พ.ศ. 2204 นิวตันได้เข้าเรียนที่วิทยาลัยทรินิตี้ เคมบริดจ์ ในฐานะซิซาร์ (sizar; คือทุนชนิดหนึ่งซึ่งนักศึกษาต้องทำงานเพื่อแลกกับที่พัก อาหาร และค่าธรรมเนียม)[8] ในยุคนั้นการเรียนการสอนในวิทยาลัยตั้งอยู่บนพื้นฐานแนวคิดของอริสโตเติล แต่นิวตันชอบศึกษาแนวคิดของนักปรัชญายุคใหม่คนอื่นๆ ที่ทันสมัยกว่า เช่น เดส์การ์ตส์ และนักดาราศาสตร์ เช่น โคเปอร์นิคัส, กาลิเลโอ และเคปเลอร์ เป็นต้น ปี ค.ศ. 1665 เขาค้นพบทฤษฎีบททวินามและเริ่มพัฒนาทฤษฎีทางคณิตศาสตร์ซึ่งต่อมากลายเป็นแคลคูลัสกณิกนันต์ นิวตันได้รับปริญญาในเดือนสิงหาคม ค.ศ. 1665 หลังจากนั้นไม่นาน มหาวิทยาลัยต้องปิดลงชั่วคราวเนื่องจากเกิดโรคระบาดครั้งใหญ่ แม้เมื่อศึกษาในเคมบริดจ์เขาจะไม่มีอะไรโดดเด่น[9] แต่การศึกษาด้วยตนเองที่บ้านในวูลส์ธอร์พตลอดช่วง 2 ปีต่อมาได้สร้างพัฒนาการแก่ทฤษฎีเกี่ยวกับแคลคูลัส ธรรมชาติของแสงสว่าง และกฎแรงโน้มถ่วงของเขาอย่างมาก นิวตันได้ทำการทดลองเกี่ยวกับแสงอาทิตย์อย่างหลากหลายด้วยแท่งแก้วปริซึมและสรุปว่ารังสีต่างๆ ของแสงซึ่งนอกจากจะมีสีแตกต่างกันแล้วยังมีภาวะการหักเหต่างกันด้วย การค้นพบที่เป็นการอธิบายว่าเหตุที่ภาพที่เห็นภายในกล้องโทรทรรศน์ที่ใช้เลนส์แก้วไม่ชัดเจน ก็เนื่องมาจากมุมในการหักเหของลำแสงที่ผ่านแก้วเลนส์แตกต่างกัน ทำให้ระยะโฟกัสต่างกันด้วย จึงเป็นไม่ได้ที่จะได้ภาพที่ชัดด้วยเลนส์แก้ว การค้นพบนี้กลายเป็นพื้นฐานในการพัฒนากล้องโทรทรรศน์แบบกระจกเงาสะท้อนแสงที่สมบูรณ์โดยวิลเลียม เฮอร์เชล และ เอิร์ลแห่งโรส ในเวลาต่อมา ในเวลาเดียวกับการทดลองเรื่องแสงสว่าง นิวตันก็ได้เริ่มงานเกี่ยวกับแนวคิดในเรื่องการโคจรของดาวเคราะห์