สรุป (มหากาพย์) Clubhouse รวยด้วย SynBio EP2: CRISPR diagnostics
(4 กรกฎาคม 2564)
>> สรุปโดย: ธนกฤต วงษ์สถิตย์ (ออสติน)
หน้ากากอนามัยที่ตรวจหาเชื้อโควิดผ่านเทคโนโลยี CRISPR/Cas https://wyss.harvard.edu/media-post/beating-back-the-coronavirus-covid-19-detecting-face-mask/
บทนำสู่ SynBio และ ตำแหน่งของ CRISPR diagnostics
1. Synthetic biology (ชีววิทยาสังเคราะห์) คืออะไรกันแน่ แม้แต่ในคนในวงการด้วยกันก็ยังนิยามไม่ตรงกัน นิยามที่น่าจะตรงสุดอันนึงคือเป็นยุคที่สองของพันธุวิศวกรรม (genetic engineering) โดยยุคแรกเริ่มต้นในช่วงปี 1970 จากการค้นพบเทคโนโลยี recombinant DNA ที่ทำให้เราเริ่มตัดต่อยีนข้ามกลุ่มสิ่งมีชีวิตได้ แต่ในช่วง 10-20 ปีที่ผ่านมา การวิศวกรรมสิ่งมีชีวิตได้มีความซับซ้อนมากยิ่งขึ้นเช่น จากที่เคยตัดต่อยีนเข้าไปในแบคทีเรียแค่ยีนเดียว ก็มีการตัดต่อเข้าไปสิบยีน ความซับซ้อนที่เกิดขึ้นส่งผลให้เราต้องคิดทุกอย่างให้เป็นระบบและมีความ quantitative มากยิ่งขึ้น
2. การที่มีเครื่องมือเจ๋งๆ หลายอย่างที่เกิดขึ้นในยุคหลังและทำให้เราวิศวกรรมสิ่งมีชีวิตได้ดีขึ้นมาก เราสามารถสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายยาวๆ เพื่อสร้างสิ่งมีชีวิตตัวใหม่ได้ การตัดต่อพันธุกรรมที่ง่ายดายและแม่นยำด้วยเทคโนโลยี CRISPR/Cas ได้ และชีววิทยาสังเคราะห์ยังได้ประโยชน์จากความก้าวหน้าในสาย computer science ในเรื่องของการวิเคราะห์ข้อมูลขนาดใหญ่และการนำ machine learning มาใช้ประโยชน์ด้วย
3. ความแตกต่างระหว่าง synthetic biology กับ biotechnology: ตามนิยาม biotechnology สามารถครอบตลุมได้ตั้งแต่ยุคดึกดำบรรพ์ที่มีการนำความรู้ทางชีววิทยามาใช้ประโยชน์ในการปรับปรุงสายพันธุ์พืชและสัตว์ แต่บางคนก็มองว่า biotechnology ต้องมีความเกี่ยวข้องกับการทำพันธุวิศวกรรมด้วย ซึ่งเราอาจจะมองว่า synthetic biology เป็นสาขาที่อยู่ใต้ร่มของ biotechnology
4. กลุ่มของบริษัทในวงการ synthetic biology แบ่งเป็นสี่กลุ่มใหญ่ๆ
A) สร้างครื่องมือที่ใช้วิศวกรรมสิ่งมีชีวิต เช่น รับสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ขายเอนไซม์ ตัวอย่างบริษัทในกลุ่มนี้คือ TWIST, NEB, IDT, Thermo Scientific ฯลฯ
B) นำสิ่งมีชีวิตที่ผ่านกระบวนการพันธุวิศวกรรมมาเลี้ยงในระบบปิด เช่น เลี้ยงเซลล์เพื่อมาทำเป็นอาหาร (cultured meat) เลี้ยงเซลล์เพื่อใช้ผลิตสารเคมีบางอย่าง (cell factory) ตัวอย่างบริษัทในกลุ่มนี้คือ Amyris, Ginkgo Bioworks, Zymergen, Spiber, Codexis ฯลฯ
C) นำสิ่งมีชีวิตที่ผ่านกระบวนการพันธุวิศวกรรมมาใช้ในระบบเปิด เช่น วิศวกรรมจุลินทรีย์เพื่อนำมาใช้เป็นปุ๋ยทางการเกษตร พืชตัดต่อพันธุกรรม gene drive ฯลฯ ตัวอย่างบริษัทในกลุ่มนี้คือ Joyn, Syngenta, Bayer, Monsanto (โดน Bayer ซื้อไปแล้ว), Oxitec ฯลฯ
D) นำ synthetic biology มาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์ เช่น gene therapy, CAR-T cell, ตัวอย่างบริษัทในกลุ่มนี้คือ Editas Medicine, Beam Therapeutics, CRISPR Therapeutics, Intellia, Sherlock Biosciences ฯลฯ
5. งานวินิจฉัยด้วย CRISPR (CRISPR Diagnostics) บางคนถือว่าไม่ใช่เป็น synbio เพราะไม่ได้เกี่ยวกับการวิศวกรรมสิ่งมีชีวิต เพียงแต่ใช้ประโยชน์จากชีวโมเลกุล ดังนั้นน่าจะจัดไปอยู่กลุ่มเดียวกับพวกทำ biosensor หรือชุดตรวจอื่นๆ อย่าง LAMP, PCR, Ag/Ab test kits (ซึ่งคนทั่วไปไม่นับว่าเป็นงาน synbio) ฯลฯ อย่างไรก็ตามเนื่องจากงานนี้ใช้ CRISPR และคนทั่วไปคุ้นเคยกับ CRISPR ในฐานะเครื่องมือปรับแก้พันธุกรรม (ซื่งเป็นงาน SynBio แท้ๆ) และนักวิจัยที่ทำ CRISPR diagnostics ก็เป็น synthetic biologist กันซะส่วนใหญ่ ดังนั้นเราก็เลยมักจะจัดว่างาน CRISPR diagnostics เป็นงาน SynBio ด้วย
ภาพรวมตลาดและเทคโนโลยีตรวจโรค
6. ตลาดการตรวจโรค (diagnostics) ในมนุษย์มีมูลค่าประมาณสี่พันล้านดอลลาร์ 70-80% เป็นการตรวจจากกรดนิวคลีอิก ใน CH เน้นเจาะเรื่องการตรวจโรคโควิด-19 เป็นพิเศษ เนี่องจากช่วงที่ผ่านมาการตรวจโรคที่เป็นประเด็นใหญ่ที่สุดก็หนีไม่พ้นโรคโควิด-19 ที่ถือเป็นตัวเร่งสำคัญที่ทำให้การรับเทคโนโลยี CRISPR มาใช้ในตรวจโรคจริงๆ
7. การตรวจโควิดมีอยู่ 3 รูปแบบคือตรวจหาโปรตีนจากตัวไวรัส (antigen) ตรวจหาโปรตีนที่เกิดขึ้นจากการตอบสนองร่างกายต่อการติดเชื้อ (antibody) และตรวจสารพันธุกรรมของไวรัส (nucleic acid) ซึ่งในกรณีที่ได้รับเชื้อ การตรวจ antigen และ nucleic acid จะตรวจเจอได้เร็วกว่าการตรวจ antibody เพราะไม่จำเป็นต้องรอให้ร่างกายตอบสนองต่อเชื้อก่อนเหมือนกับการตรวจ antibody
8. การตรวจโดยใช้เทคนิค qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)* ถือเป็น gold standard [1] ของการตรวจโควิดเพราะมี sensitivity สูงมาก (มีเชื้ออยู่น้อยมากก็ยังตรวจเจอได้) และสามารถบอกปริมาณเชื้อที่อยู่ในตัวอย่างได้ด้วย
9. วิธีหนึ่งที่สามารถทำให้ตรวจโรคได้เร็วขึ้นและประหยัดน้ำยาที่ใช้คือการนำอย่างหลายสิบอันมารวมกันแล้วตรวจด้วย RT-PCR ในคราวเดียว (pooled testing) โดยใน guideline ของ CDC [2] บอกว่าถ้าผลตรวจจากการนำตัวอย่างมารวมกันเป็นลบ ก็ถือว่าผลตรวจของทุกคนที่อยู่ในตัวอย่างเป็นลบ แต่ถ้าผลตรวจเป็นบวกก็ให้ทดสอบแยกรายคนอีกครั้ง โดยจำนวนตัวอย่างที่ควรนำมารวมกันควรขึ้นอยู่กับอุบัติการณ์(incidence) ของโรคโควิดในพื้นที่นั้นๆ ถ้ามีน้อยก็สามารถตรวจพร้อมกันเยอะๆ ได้
10. CovidNudge ของโทนี่ก็เป็น RT-PCR แต่มีการย่อส่วนอุปกรณ์ให้พกพาได้ง่าย โดยใช้ร่วมกับตัว sample processing unit ที่สร้างขึ้นเพื่อเตรียมตัวอย่างที่ได้จากการทำ nasopharyngeal swab [3,4] โดยปกติการตรวจหนึ่งครั้งจะเสียเงิน 100 ปอนด์แต่ CovidNudge ก็สามารถทำ pooled testing ศูงสุดถึงครั้งละ 10 คน [5] ก็ทำให้ค่าตรวจสามารถถูกลงได้ถึง 10 เท่า โดยอนุญาตให้คนกลุ่มที่มีความเสี่ยงเท่ากันเช่น คนในครอบครัวเดียวกัน ตรวจด้วยกัน
CovidNudge ที่มา: Imperial College London
ถ้าตรวจพร้อมกันทีละหลายสิบตัวอย่างอาจจะยังไม่จุใจ ก็มีคนเสนอให้เอาดีเอ็นเอสายสั้นๆ แปะเป็นบาร์โค้ดติดเข้ากับสารพันธุกรรมของแต่ละตัวอย่างแล้วนำไปทำ next-generation sequencing ถ้าเจอลำดับสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัส ก็ไปเช็คดูตรงบาร์โค้ดว่าเป็นของคนไหน แม้ว่าวิธีนี้จะทำให้ตรวจหลายหมื่นตัวอย่างได้พร้อมๆ กัน แต่ก็มีข้อเสียตรงที่กระบวนการนี้ใช้เวลานานกว่าการตรวจวิธีอื่นๆ (อย่างน้อย 12 ชั่วโมง)
11. แม้ว่า RT-PCR จะเป็นวิธีการตรวจโรคแบบมาตรฐาน แต่ข้อเสียอย่างหนึ่งของเทคนิคนี้คือการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมจะต้องมีการเปลี่ยนอุณหภูมิสลับไปเรื่อยๆ หลายรอบ จึงต้องใช้เครื่อง thermocycler ที่มีราคาแพง
12 ดังนั้นเลยมีคนพัฒนาเทคนิคการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมด้วยอุณหภูมิคงที่ (isothermal amplification) อย่างเช่น LAMP (loop-mediated isothermal amplification) หรือ RPA (recombinase polymerase amplification) ขึ้นมา
เทคนิคการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมด้วยอุณหภูมิคงที่ (isothermal amplification)
13. LAMP จะทำงานที่อุณหภูมิประมาณ 60 องศาเซลเซียส โดยจะใช้ primer 4-6 อันในการสร้าง DNA ที่มีโครงสร้างเหมือนดัมเบลขึ้นมา ด้วยเหตุที่ว่า primer สามารถจับกับดัมเบลได้หลายจุด จึงทำให้การเพิ่มปริมาณได้อย่างรวดเร็ว แต่ปัญหาอันหนึ่งคือการออกแบบ primer ที่ออกแบบได้ยาก
14. RPA ใช้เอนไซม์ recombinase ที่สามารถจับกับ primer เพื่อแยกสายดีเอ็นเออย่างจำเพาะและสอด primer เข้าไปในเวลาเดียวกัน เปิดทางให้ DNA polymerase มาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายได้ (ปกติเทคนิค PCR จะแยกสายดีเอ็นเอโดยใช้อุณหภูมิสูงประมาณ 90 องศาเซลเซียส)ทำงานที่อุณหภูมิประมาณ 37-42 องศาเซลเซียส ดังนั้นสามารถใช้มือกำหลอดหรือเอาไปหนีบรักแร้ก็สามารถใช้งานได้ ทำให้เรายังสามารถทำงานได้แม้ไม่มีเครื่องมือ แม้ว่าเทคนิคนี้จะใช้ primer 2 สายเหมือนกับ PCR ข้อเสียของ RPA คือเราไม่สามารถทำนายได้ว่า primer คู่ไหนจะทำงานได้ดีเหมือนกับเวลาที่เราทำ PCR
15. อย่างไรก็ตาม RPA ก็มีข้อเสียเหมือน isothermal amplification แบบอื่นๆ ตรงที่มัน nonspecific product เยอะมาก ทำให้ในกระบวนการ optimize ต้องทดลองกับ primer หลายคู่มากเพื่อจะหาตังที่ไม่มี nonspecific product
16. ทั้งหมดที่พูดถึงก่อนหน้านี้ล้วนเป็นการตรวจหา nucleic acid ทั้งหมด แต่ยังมีการตรวจอีกรูปแบบหนึ่งซึ่งให้ผลเร็วและมีราคาถูกคือการตรวจหา antigen หรือที่มักจะเรียกกันสั้นๆ ว่า ATK ซึ่งความเร็วและราคาที่ได้ก็แลกมาด้วย sensitivity ที่ต่ำกว่าการทำ RT-PCR เพราะไม่ได้มีกระบวนการขยายสัญญาณ (ในกรณีของ RT-PCR ก็คือการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม)
*ทวนเรื่อง central dogma แบบเร็วๆ สิ่งมีชีวิตทุกชนิดเก็บข้อมูลอยู่ในรูปของ DNA แต่จะมีการถอดรหัสออกมาเป็น RNA ก่อนที่ใช้ RNA มาแปลรหัสแล้วสร้างเป็นโปรตีนออกมา แต่ตัวไวรัส SARS-CoV-2 ใช้ RNA ซึ่งมีความเสถียรน้อยกว่า่ DNA เป็นสารพันธุกรรม ดังนั้นถ้าเราจะใช้กระบวนการ PCR ซึ่งเป็นวิธีการเพิ่มปริมาณ DNA เพื่อตรวจเชื้อโควิด ก็จำเป็นจะต้องเพิ่มกระบวนการ reverse transcription ที่เป็นการเปลี่ยนจาก RNA เป็น DNA เข้าไปด้วย
CRISPR/Cas คืออะไร? เป็นมายังไง?
17. CRISPR/Cas เป็นระบบภูมิคุ้มกันที่แบคทีเรียกับอาร์เคียใช้เพื่อปกป้องตัวเองจาก bacteriophage (ไวรัสกินแบคทีเรียเรียกสั้นๆ ว่า phage) ทำงานโดยการนำเศษชื้นส่วนดีเอ็นเอของ phage ที่เข้ามารุกรานเก็บไว้ในดีเอ็นเอของตัวเอง ซึ่งพื้นที่พิเศษตรงนี้มีชื่อเรียกว่า CRISPR ซึ่งสามารถถอดรหัสออกมาเป็น crRNA แล้วมาประกอบร่างกับโปรตีนที่มีชื่อว่า Cas ในกรณีที่ไวรัสชนิดเดิมบุกเข้ามาในแบคทีเรีย crRNA จะสามารถแจ้งเตือน Cas ได้ว่า ดีเอ็นเอตัวนี้เป็นส่วนหนึ่งของ phage โดยเช็คได้จากการจับคู่ที่มีความจำเพาะของลำดับเบสระหว่าง crRNA กับดีเอ็นเอของไวรัส (A จับกับ U/T, C จับกับ G) พอดีเอ็นเอตัวของ phage ถูกตัดเป็นชิ้นๆ ก็จะเป็นอีกครั้งที่เซลล์แบคทีเรียอยู่รอดปลอดภัย ไม่ถูกเปลี่ยนเป็นโรงงานผลิตไวรัส
การทำงานของระบบ CRISPR/Cas ในธรรมชาติ ที่มา: https://www.nature.com/articles/s41586-019-1894-8
18. หลังจากที่นักวิทยาศาสตร์เริ่มเข้าใจกระบวนการทำงานของ CRISPR/Cas ก็มีคนที่มองว่าเราสามารถโปรแกรมระบบนี้ให้ตัดดีเอ็นเอในตำแหน่งอะไรก็ได้ตามที่เราต้องการด้วยการปรับเปลี่ยนตัว crRNA ในจุดนี้อาจจะมีบางคนที่นึกถึงเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) ที่มนุษย์ไปเอามาจากระบบภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียและสามารถตัดสายดีเอ็นเอได้ในแบบเฉพาะเจาะจงเหมือนกัน ความแตกต่างอยู่ตรงที่เอนไซม์ตัดจำเพาะ 1 ตัวจะสามารถค้นหาและตัดดีเอ็นเอที่มีลำดับเบสได้รูปแบบเดียวเท่านั้น
19. แต่ CRISPR/Cas ไม่ได้เป็นเทคโนโลยีแรกที่ถูกคาดหวังว่าจะมาเป็นเครื่องมือที่ใช้ตัดต่อจีโนมได้ เครื่องมือที่ถูกใช้ในช่วงเวลาก่อนหน้านั้นมีอยู่สองตัวคือ Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) กับ Zinc finger nuclease (ZFN) ซึ่งทั้งคู่ใช้โปรตีนที่สามารถจับกับลำดับเบสสั้นๆ (1 กับ 3 เบส) ได้แบบจำเพาะ เวลาจะใช้งานก็เอาโปรตีนพวกนี้หลายๆ ตัวมาต่อกันเหมือนกับต่อเลโก้ แต่พอเอาโปรตีนหลายๆ ตัวมาต่อกัน ความยาวของสาย DNA ที่เป็นพิมพ์เขียวในการสร้างก็ยาวตามไปด้วย ทำให้เทคโนโลยีกลุ่มนี้มีราคาสูงเมื่อเทียบกับ CRISPR/Cas ที่ต้องการโปรตีน 1 ตัวกับ crRNA ที่มีความยาวประมาณ 20 เบส
เทคโนโลยีตัดต่อจีโนม ก้อนหลากสีที่เห็นใน ZFN และ TALEN สะท้อนถึงการนำโปรตีนจับเบสสั้นๆ หลายตัวมาต่อกัน ที่มา: https://www.nature.com/articles/s41571-019-0166-8
20. จุดต่างอีกอย่างหนึ่งที่สำคัญคือในระบบ CRISPR/Cas ตัว crRNA จะเป็นตัวกำหนดลำดับเบสที่ควรตัด แต่ในกรณีของเอนไซม์ตัดจำเพาะ/Zinc finger nuclease/TALENs ตัวที่กำหนดคือตัวโปรตีนเองซึ่งไม่มีกฎการจับที่ตายตัวเหมือนกับการจับกันของคู่เบส ทำให้การออกแบบง่ายขึ้นมาก
21 . CRISPR ถูกค้นพบในฐานะลำดับดีเอ็นเอแปลกๆ ตั้งแต่ช่วงปี 1980 แต่เพิ่งรู้หน้าที่ว่ามีความเกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน มีเอนไซม์เป็นตัวตัด มี crRNA เป็นตัว guide ช่วงปี 2000 แต่การนำมาใช้งานเพื่อตัดต่อพันธุกรรมเริ่มเกิดขึ้นในปี 2012 โดยมีทีมวิจัย 4 ทีมที่ทำสำเร็จในเวลาไล่เลี่ยกัน คือ Jennifer Doudna กับ Emmanuelle Charpentier (UC Berkeley/University of Vienna), Feng Zhang (MIT), George Church (Harvard), คิมจินซู (Seoul National University) ก็เลยมีดราม่าเรื่องสิทธิบัตรเกิดขึ้น
ผู้บุกเบิกวงการ CRISPR genome editing
22. ระบบสิทธิบัตรของแต่ละประเทศไม่เหมิอนกัน ตอนแรกของอเมริกาเป็นระบบใครจดก่อน ได้ก่อนแล้วเพิ่งเปลี่ยนมาจากระบบใครคิดค้นก่อน ได้ก่อนช่วงที่มีดราม่าเกิดขึ้นพอดี ต้องคุ้ยดูสมุดแล็บ ดูอีเมล ทั้งนี้ เวลาจดสิทธิบัตรอันใหม่ต้องไม่เป็น obvious application ของสิ่งที่มีอยู่เดิม อย่างเช่น ถ้ามีคนจดสิทธิบัตรของขนมเค้กกล้วยหอมอยู่แล้ว เราจะไม่สามารถไปจดสิทธิบัตรของขนมเค้กกล้วยไข่ได้
23. ซึ่งตอนแรกทีม Doudna เริ่มยื่นขอสิทธิบัตรโดยใช้ผลการทดลองที่ตัวเองทำในหลอดทดลองแล้วเคลมว่า CRISPR/Cas สามารถใช้ตัดต่อพันธุกรรมสิ่งมีชีวิตได้โดยทั่วไป ส่วนฝั่ง Feng Zhang บอกว่าสามารถใช้ตัดต่อเซลล์ eukaryote ได้ ซึ่งจริงๆแล้วการตัดต่อพันธุกรรมที่จะมีมูลค่าสูงก็เป็นการตัดต่อพันธุกรรมของเซลล์มนุษย์ที่เป็นเซลล์ยูคาริโอตแล้วทั้งสองฝั่งก็เริ่มเถียงกันเรื่องความ obvious ทีม Doudna พยายามบอกว่ามัน obvious อยู่แล้วว่า CRISPR/Cas จะใช้ใน eukaryote ได้ ซึ่งฝั่ง Feng Zhang ก็บอกมาไม่ obvious โว้ย
24. Charpentier รวมหัวกับเพื่อนๆ ในยุโรปแล้วก็มาคุยกับทั้ง Doudna, Zhang, Church ว่าจะมาตั้งบริษัทที่ทำเทคโนโลยี CRISPR/Cas ร่วมกัน แต่ก็แยกออกเป็น 2 บริษัทคือ CRISPR therapeutics ของ Charpentier และเพื่อนๆ ในยุโรป กับ Editas medicine กับทีมจากอเมริกา แต่สุดท้าย ไม่ว่าจะเป็นแรงยุจากนักงทุนหรือมหาวิทยาลัยก็ตาม Doudna ก็แยกวงออกมาตั้ง Intellia Therapeutics (จะลงแบบเจาะลึกตอนที่พูดถึง CRISPR therapeutics)
25. สิทธิบัตรก็เป็นช่องทางหนึ่งที่จะรวยได้ การยุจากมหาวิทยาลัยที่อยากให้นักวิจัยจดสิทธิบัตรโดยไม่ยุ่งกับมหาวิทยาลัยอื่นก็เป็นไปได้เพราะถ้ามหาลัยเป็นคนจดสิทธิบัตร แล้วมีบริษัทไหนก็ตามที่นำสิทธิบัตรนั้นไปใช้งาน บริษัทนั้นก็ต้องจ่ายค่า license ให้มหาวิทยาลัย ถ้างานไหนมีความสำคัญมากๆ แล้วมีคนต้องการ license เยอะ มหาวิทยาลัยก็จะรวย ตัวอย่างเช่นภาควิชาพันธุศาสตร์ของ Stanford ที่ถือสิทธิบัตรสำคัญ 2 ตัวคือ recombinant DNA กับ flow cytometry (การนำเซลล์ผ่านแสงเลเซอร์ด้วยความเร็วสูง ทำให้รู้คุณสมบัติของเซลล์ปริมาณมหาศาลในระยะเวลาสั้นๆ)
CRISPR/Cas มาเกี่ยวกับ diagnosis ได้ไง?: Cas บ้าเลือด
26. Cas เป็นเอนไซม์ที่มี variant อยู่หลายรูปแบบ บางตัวต้องอยู่ด้วยกันเป็นกลุ่มก้อนโปรตีนถึงจะทำงานได้ บางตัวฉายเดี่ยวเป็นโปรตีนก้อนเดียว บางตัวค้นหาและตัดเป้าหมายที่เป็น DNA บางตัวตัด RNA
27. Cas ตัวหลักที่ใช้ตัดต่อพันธุกรรมมีชื่อเรียกว่า Cas9 แต่ Cas ที่ใช้สำหรับการตรวจโรคหลักๆ จะเป็น Cas12 และ Cas13 ซึ่งมีคุณสมบัติพิเศษที่เรียกว่า collateral activity
28. Collateral activity คือปรากฏการณ์ที่ Cas จะ ”บ้าเลือด”หลังจากที่มันได้พบกับเป้าหมายแล้ว ตัวอย่างเช่น Cas13 จะปลดล็อกความสามารถในการตัด RNA ทุกสายที่ขวางหน้า หลังจากที่ crRNA สามารถจับคู่และยืนยันว่าพบ RNA เป้าหมายแล้ว โดยมีงานวิจัยที่ suggest ว่าการทำลาย RNA แบบไม่เลือกหน้าของ Cas13 ในธรรมชาติอาจจะทำให้เซลล์แบคทีเรียที่ติดเชื้อเข้าสู่สภาวะ’จำศีล’ ชัตดาวน์กระบวนการทำงานของเซลล์และลดการแพร่กระจายของไวรัสออกไปสู่เพื่อนร่วมเผ่าพันธุ์ [6]
29. แล้วเราจะเอา collateral activity มาใช้ตรวจเชื้อได้ยังไง สมมติว่าเราต้องการอ่านผลโดยดูจากการเรืองแสง fluorescence ด้วยการใช้เอนไซม์ Cas12 ตัวระบบการตรวจจะมีองค์ประกอบหลัก 3 อย่าง
1) Cas12 ที่จะบ้าเลือดตัด DNA สายเดี่ยว* (single-stranded DNA) ถ้า crRNA พา Cas12 ไปเจอกับ DNA เป้าหมาย (ความต่างหลักๆ ของ Cas12 กับ Cas13 คือเป้าหมายที่เอนไซม์ตัดได้)
2) crRNA ที่จะพา Cas12 ไปหาเป้าหมาย ถ้าโรคเป้าหมายเปลี่ยนไปจากเดิม สิ่งที่ต้องทำก็แค่ออกแบบลำดับเบสของ crRNA ใหม่ ส่วนองค์ประกอบอื่นๆ ก็ยังคงใช้ได้เหมือนเดิม
3) ตัว reporter เปรียบเสมือนเป็นแพะรับบาปที่จะถูกตัดเวลา Cas12 บ้าเลือดขึ้นมา มีไว้เพื่อรายงานว่าในตัวอย่างที่นำมาตรวจมี DNA เป้าหมายอยู่หรือไม่
เพื่อให้ Cas12 ตัดได้ องค์ประกอบของ reporter จึงเป็น DNA สายเดี่ยว
เพราะว่าเราอยากให้ reporter เรืองแสงได้เลยติดสารเรืองแสง (fluorophore) ไว้ที่ปลายด้านหนึ่งของสาย DNA แต่ว่าเราต้องการให้มันเรืองแสงเฉพาะเวลาที่ reporter โดน Cas12 ตัด ปลายอีกด้านของสาย DNA จึงติดสารดูดพลังงาน (quencher)
30. ถ้าไม่มีเชื้อเป้าหมายอยู่ในตัวอย่าง Cas12 จะไม่บ้าเลือด DNA reporter ก็จะไม่โดน Cas12 ตัด ในเมื่อสารเรื่องแสงยังคงอยู่ใกล้กับสารดูดพลังงาน (มี DNA เชื่อมอยู่) ต่อเราฉายแสงช่วงความยาวคลื่นจะกระตุ้นให้ fluorophore เรืองแสงได้ ก็จะไม่มีการเรืองแสงเกิดขึ้นเพราะยังมี quencher ที่คอยดูดพลังงานอยู่ใกล้ๆ กับ fluorophore (ถ้าเรืองแสงได้เองโดยไม่ต้องมีแหล่งพลังงานอื่นมากระตุ้นจะเรียก luminescence เช่น แสงของหิ่งห้อย)
31. ในทางกลับกัน ถ้ามีเชื้อเป้าหมายอยู่ในตัวอย่าง crRNA จะสามารถเข้าคู่กับ DNA เป้าหมายได้ ส่งผลให้ Cas12 เกิดบ้าเลือดขึ้นมา DNA reporter จะถูกตัดและส่งผลให้ fluorophore กับ quencher แยกออกจากกันและสามารถตรวจพบสัญญาณการเรืองแสงได้
32. ทั้งนี้ อย่าลืมว่าตอนที่ Cas12 บ้าเลือดมันจะตัด DNA ทุกสายที่ขวางหน้า ดังนั้นถ้า Cas12 เจอ DNA ของเชื้อเป้าหมาย 1 ชื้นแล้วบ้าเลือดไปตัด reporter ได้ 1000 ชื้นก็เหมือนเป็นการขยายสัญญาณเพิ่มขึ้น 1000 เท่า
“สมมติว่าแบบมีคนไปชุมนุมรวมกัน แล้วก็มีคนที่เป็นนักข่าวอยู่ในที่ชุมนุมด้วย ก็คือตอนแรกอาจจะไม่มีอะไร แต่พอมีแกนนำที่เราต้องการจะจับ รัฐบาลก็จะฉีดเริ่มน้ำมั่วแล้วมีนักข่าวโดนลูกหลง”
* ใช่ครับ ดีเอ็นเอไม่จำเป็นต้องอยู่เป็นเกลียวคู่ ไวรัสที่เป็น DNA สายเดี่ยวก็มีอยู่หลายตัว
เล่าประสบการณ์การทำ CRISPR diagnostics
33. อ.เบนซ์เอา CRISPR/Cas มาใช้ตรวจโรคในกุ้งและปลา การตรวจมี 2 ขั้น เริ่มจากการใช้ RPA (recombinase polymerase amplification) มาปั๊มดีเอ็นเอให้ออกมาเยอะๆ ก่อน แล้วใช้ Cas12 ในการตรวจหาดีเอ็นเอเป้าหมาย ถ้ามีดีเอ็นเอเป้าหมายอยู่ก็จะมีการเรืองแสง fluorescence เกิดขึ้น ทั้ง RPA ทั้ง Cas สามารถทำที่ 37 องศาเซลเซียสในหลอดเดียวกันได้
34. เนื่องจากการเรืองแสงต้องมีแหล่งพลังงานภายนอกมากระตุ้น ตอนใช้งานจึงต้องมีหลอดไฟ (transilluminator) ร่วมด้วย แต่ในกรณีที่ไม่อยากพกพาตัวหลอดไฟไปด้วย ก็สามารถเปลี่ยนไปใช้แถบ lateral flow ที่มีหน้าตาเหมือนชุดตรวจการตั้งครรภ์ได้ แต่ก็ต้องเปลี่ยนตัว reporter ด้วย (ความแตกต่างอยู่ตรงโมเลกุลที่เชื่อมติดอยู่กับ DNA reporter)
35. ส่วนที่จะต้องใส่ใจมากเป็นพิเศษตอนสร้างชุดตรวจคือกระบวนการ RPA ถ้ามีปัญหา limit of detection จะตกลงไปเป็นร้อยเท่า แม้จะดูยุ่งยาก แต่ปัจจุบันการตรวจโรคด้วย CRISPR/Cas ส่วนมากก็ยังต้องใช้กระบวนการเพิ่มสารพันธุกรรมอย่าง RPA หรือ LAMP ก่อนจะให้ CRIPR/Cas ทำงานเพราะถ้าใช้แค่ CRISPR/Cas อย่างเดียวจะทำให้ limit of detection หายไปเป็นล้านเท่า
36. ในส่วนของราคาระหว่างการทำ PCR กับการใช้ CRISPR/Cas เพื่อตรวจโรคสัตว์น้ำก็ไม่ได้ต่างกันมากนัก จากตารางตรวจโรคของกรมประมง ค่าน้ำยาทำ PCR จะอยู่ที่ประมาณ 20 บาท ส่วนการใช้ RPA ร่วมกับ CRISPR/Cas ถ้าอ้างอิงจากการคำนวณของแล็บ Feng Zhang ตัวราคาค่าน้ำยาที่ในกรณีที่ผลิตสารบางอย่างได้เองจะตกอยู่ที่ประมาณ 60 เซ็นต์ ถือได้ว่ามีราคาน้ำยาใกล้เคียงกัน แต่อย่าลืมว่าการทำ PCR ก็มี fixed cost จาก thermocycler ด้วย
37 . ราคาแถบ lateral flow ของชุด commercial อยู่ประมาณแถบละ 100 บาท อ.เบนซ์ก็เลยส่งเสริมให้เกษตรกรใช้ระบบการอ่านผลด้วยแสง fluorescence มากกว่าเพราะในระยะยาว การซื้อเครื่อง transilluminator จะถูกกว่าการซื้อแถบ แต่การทำแถบเองในประเทศก็อาจจะทำให้ราคาถูกลง
แถบ lateral flow strip ที่ใช้อ่านผลการตรวจด้วย CRISPR/Cas ที่มา: https://news.mit.edu/2020/sherlock-based-one-step-test-provides-rapid-sensitive-covid-19-detection-0505
38. พี่นิคจากคณะแพทย์ จุฬาฯ เล่าว่าโปรเจค CRISPR diagnostics ของพี่เขาก็มีการทดลองกับ clinical sample แล้วก็เตรียมจะตีพิมพ์เหมือนกัน เขาเคยลองใช้แถบที่ผลิตในไทย ตกราคาประมาณแถบละ 85 บาท ยิ่งสั่งเยอะยิ่งถูก แต่บริษัทเขาบอกว่ามีความแตกต่างอยู่ตรง antibody ที่อาจจะทำให้จับเป้าหมายได้ไม่แน่นเท่า ถ้า Cas ตัด reporter ได้สมบูรณ์จะขึ้นมาแค่แถบเดียว (lateral flow ของไทย)
39. ออสตินไปทำชุดตรวจโควิดที่ VISTEC ตอนนั้นใช้เทคนิค SHERLOCK ที่ทีม Feng Zhang คิดค้นขึ้นโดยเป็นการใช้ RPA ตามด้วยการใช้ Cas13 คือถ้าไม่มีกระบวนการ RPA แล้วใช้ CRISPR/Cas อย่างเดียวเทคนิคนี้จะมี sensitivity ลดลงไปล้านเท่า ตอนที่ทำช่วงแรกรู้สึกว่าขั้นตอนที่ยากที่สุดตือการผสมสาร ซึ่งความยากตรงนี้ก็เป็นปัจจัยที่ขัดขวางการใช้งานในภาคสนามเพราะต้องมีการเทรนบุคลากรให้มีความคุ้นเคยกับกระบวนการทำงาน แต่ปัญหาตรงนี้ก็มีคนแก้ไขด้วยการสร้าง one-pot protocol (ใส่ตัวอย่างเข้าไปแล้วรอผลออกอย่างเดียว ไม่ต้องผสมสารแล้ว) ขึ้นมา ส่วนการอ่านผลก็มีการทดลองทั้งแบบดูการเรืองแสง fluorescence กับใช้แถบ lateral flow แต่ก็มองว่าการใช้ lateral flow น่าจะเหมาะสมกับการใช้ที่บ้านมากกว่าเพราะไม่ต้องมีตัว transilluminator
ระบบ SHERLOCK ใช้เอนไซม์ Cas13 ที่จะบ้าเลือดตัด RNA reporter ที่จะเรืองแสงตอนถูกตัด (b) หลังจากไปเจอกับ RNA เป้าหมาย (a) เมื่อนำมาใช้ร่วมกับการทำ RPA เลยเกิดเป็นระบบนี้ขึ้นมา (ถ้าอยากตรวจ RNA ก็ต้องทำ reverse transcription ด้วยเลยเป็น RT-RPA) (c) ที่มา: https://www.nature.com/articles/s41596-019-0210-2
40. ในเปเปอร์ที่ทีมจาก VISTEC ตีพิมพ์ตอนปีที่แล้ว มีการออกแบบแถบเพิ่มขึ้นมาอีกอันหนึ่งเพื่อ detect การปนเปื้อน RNase ซึ่งสามารถตัดตัว RNA reporter ทั้งๆที่ Cas ไม่ได้เจอกับ RNA ของเชื้อ (เลยไม่มี collateral activity) ได้ และการปนเปื้อนแบบนี้สามารถทำให้เกิดผลบวกปลอมได้
41. ข่าวล่าสุดตอนนี้ ทีม VISTEC ได้วิศวกรรมเอนไซม์ Cas ทำงานไวว่าเดิม, hack ระบบ RPA (ซึ่งตอนนี้ผูกขาดโดยบริษัท twistdx) ให้เราผลิตได้เองในไทยเพื่อลดต้นทุนและ ประสิทธิภาพสูงขึ้น, นอกจากนี้ยังอัพเกรดระบบให้ใช้ง่ายยิ่งขึ้นไปอีกเพื่อใหนนำไปใช้ที่บ้านได้ (Point-of-Care Test มีหลายระดับ แบบใช้เองที่บ้านทำยากสุดเพื่อให้มันใช้ง่ายสุด) สถานะปัจจุบันรออย.รับรองอยู่
42. Cas13 เหมาะกับการทำ one-pot มากกว่า Cas12 เพราะว่าตอนที่ collateral activity ของ Cas12 เกิดขึ้นมันจะไปตัด RPA primer ที่เป็น DNA ด้วยทำให้ประสิทธิภาพของการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมลดลง แต่ Cas13 จะตัด RNA ก็เลยไม่มีปัญหา สามารถทำ RPA + CRISPR ในหลอดเดียวได้ด้วย
ธุรกิจ CRISPR diagnostics
43. บริษัทในวงการ CRISPR diagnostics ก็จะมีอยู่ 2 บริษัทหลักๆ คือ Mammoth Bioscience ของ Jennifer Doudna กับ Sherlock Bioscience ของ Feng Zhang โดย Mammoth เน้นตรวจแบบ Centralized ส่วน Sherlock เน้นตรวจที่บ้านมากกว่า
44. เทคโนโลยีที่สำคัญของ Sherlock Bioscience ก็มีชื่อว่า SHERLOCK ตามชื่อบรืษัท ซึ่งเทคนิคนี้ถูกคิดค้นขึ้นหลังจากการค้นพบ collateral activity (ความบ้าเลือด) ใน Cas13 ในส่วนของ Mammoth Bioscience ก็มีเทคโนโลยี DETECTR ที่เกิดขึ้นหลังจากทีมของ Doudna ค้นพบ collateral activity ใน Cas12 (จะเห็นว่าชื่อเทคนิคการตรวจมีการตั้งล้อกันในธีมนักสืบที่จริงๆ แล้วยังมีอีกหลายอันอย่าง HOLMES หรือ CONAN)
ความแตกต่างระหว่าง SHELOCK กับ DETECTR ที่มา: https://www.nature.com/articles/s41551-021-00760-7
45. ตอนนี้ CRISPR diagnostics ที่ FDA อนุญาตให้ใช้เป็นการฉุกเฉิน (Emergency Use Authorization : EUA) มีอยู่ 3 เจ้าคือ Sherlock, Mammoth แล้วก็อีกเจ้าจาก UCSF [7]
46. ถึงแม้ว่า FDA จะอนุมัติแล้ว แต่ปัจจุบันก็ยังไม่มี CRISPR diagnostics จากบริษัทไหนที่สามารถนำมาใช้เองที่บ้านได้ เพราะว่าระดับการอนุญาตตามมาตรฐาน CLIA ยังอยู่ในระดับ high อยู่ โดยที่ CLIA มีอยู่ 3 category คือ waiver (ใช้ง่ายมาก โอกาสตรวจพลาดน้อย ไม่ต้องผ่านการควบคุมพิเศษ ที่ผ่านก็มีตระกูล qPCR แล้วก็ Roche ต่างๆ), moderate, high ชุดตรวจที่ค้นหา nucleic acid จาก 180 กว่าแบบ ผ่าน waiver ไปแค่ 3-4% เท่านั้น ส่วนใหญ่ก็เป็น moderate หรือ high ที่ให้ใช้ได้ในแล็บที่มีการดูแลเป็นพิเศษจาก FDA
47. Mammoth ก็แก้เกมตรงนี้ด้วยการไปร่วมมือกับบริษัทที่ทำ automated device อย่าง Hamilton และ Agilent แล้วออกผลิตภัณฑ์เป็นเครื่องตรวจโรคโควิดอัตโนมัติที่ตรวจได้ทีละเยอะๆ ออกมา อย่างไรก็ตาม ทั้งสองบริษัทก็อยากนำเทคโนโลยีของตัวเองไปให้ถึงการทำ point-of-care testing ได้ (ต้องผ่าน CLIA waiver ของ FDA) โดย Mammoth ก็ได้มีความร่วมมือกับ GSK ตั้งแต่เดือนพฤษภาคมปีที่แล้วส่วน Sherlock ก็ร่วมมือกับบริษัท Binx Health ที่เคยมีประวัติทำ point-of-care testing สำหรับโรคหนองในแลละโรคหนองในเทียมที่ผ่านมาตรฐาน FDA มาแล้ว และทางฝั่ง Sherlock ก็ได้ยื่นของ waiver ไปให้ FDA ตั้งแต่เดิอนพฤษภาคมที่ผ่านมา
ระบบตรวจโรคโควิดแบบอัตโนมัติที่ Mammoth Bioscience พัฒนาร่วมกับ Hamilton
ประเมินคุณภาพของเทคนิคการตรวจ
48. ดู limit of detection เช่นตรวจเจอ viral particle 1 อันที่อยู่ในตัวอย่าง 1 ไมโครลิตรได้ ตัวเลขยิ่งต่ำก็แปลว่ายังตรวจได้ในตัวอย่างที่มีความเจือจาง
49. ดู specificity ว่าแยกเชื้อที่มีความใกล้เคียงกันได้ดีแค่ไหน ปกติในเปเปอร์ก็จะมีบอกว่า true positive rate (มีเชื้อ ผลตรวจเป็นบวก), false negative rate (มีเชื้อแต่ผลตรวจเป็นลบ) เป็นเท่าไหร่
50. ปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการใช้งานจริง ไม่ว่าจะเป็นเรื่องราคา เวลาที่ใช้ตรวจ อุปกรณ์ที่ใช้ ต้องมีผู้ชำนาญเทคนิคพิเศษไหม
เปเปอร์ที่น่าสนใจช่วงหลังๆ
51. ทิศทางการพัฒนาระบบการตรวจโรคด้วย CRISPR/Cas ในปัจจุบัน สามารถแบ่งได้เป็น [11]
1) ค้นหาวิธีที่จะไม่ต้องใช้กระบวนการเพิ่มสารพันธุกรรมก่อนการตรวจด้วย CRISPR/Cas
2) ทำให้การตรวจด้วย CRISPR/Cas สามารถบอกปรืมาณเชื้อในตัวอย่างได้เหมือนกับ RT-PCR (ตอนนี้บอกได้แค่ว่ามีหรือไม่มีเชื้อ)
3) ตรวจหาหลายๆ เป้าหมายได้พร้อมกัน เช่น ตรวจหายีน 2 ตัวของเชื้อโควิด ก็จะช่วยให้ผลตรวจมีความน่าเชื่อถือมากยิ่งขึ้น
4) นำไปใช้ร่วมกับการทำ sequencing เพราะการอ่านโดยตรงว่าในตัวอย่างมีดีเอ็นเออะไรอยู่บ้างก็สามารถทำให้เราค้นพบเชื้อโรคสายพันธุ์ใหม่ได้
5) ทำให้การใช้งานจริงง่ายกว่าเดิมและมีราคาถูกลง เช่น พัฒนาระบบการอ่าน/แปลผลด้วยอุปกรณ์ง่ายๆ ตรวจหาเชื้อด้วยน้ำลายแทน nasopharyngeal swab
52. งานจาก UCSF ลงในวารสาร Cell บอกว่าไม่ต้องทำ pre-amplification โดยใช้ crRNA 2 ตัวเพื่อลด limit of detection (ความเข้มข้นต่ำสุดที่จะตรวจเชื้อเจอได้) ให้ต่ำลงแล้วก็ใชแอพในมือถือแปลผล แต่อ.เบนซ์บอกว่าปัญหาอยู่ตรงวิธีการที่เขานิยาม limit of detection ต่างจาก negative control น้อยมาก ถ้าอ.เบนซ์เป็นคนทำ เขาจะไม่ทำแบบนั้นเพราะมันแยกด้วยตาเปล่าไม่ออก แต่ในเปเปอร์ก็เคลมว่าแอพมันแยกออกนะ [9]
53. ระบบ SATORI ของทีมจากญี่ปุ่นในช่วงเวลาไล่เลี่ยกัน บอกว่าไม่ได้ใช้ pre-amplification ใช้ microchamber เป็นกลุ่มของหลุมเล็กๆที่แต่ละหลุมจะมีรูขนาด 1 เฟมโตลิตร (ขนาดประมาณ E. coli 1 เซลล์) เขาเคลมว่าถ้ามีหลุมมากพอ RNA 1 ชิ้นจะเข้าไปใน 1 รู แล้วใช้ Cas13 หา RNA ของเชื้อ แล้วถ้านับจำนวนหลุมที่มีสัญญาณ fluorescence ก็จะพอบอกได้ด้วยว่าแต่ละหลุมมี RNA อยู่มากแค่ไหน คล้ายๆ กับ digital PCR [10]
54. หน้ากากตรวจโควิดจากทีมของ James Collins ในหน้ากากมี microchamber ที่แบ่งเป็นสามส่วนย่อยตามขั้นตอนการตรวจโรคด้วย CRISPR/Cas ทั่วไป (สกัด RNA, ทำ RT-RPA , ตรวจด้วย Cas12) และมีการ optimize คุณสมบัติของ polymer ที่อยู่ระหว่าง compartment เพื่อที่จะได้ควบคุมเวลาที่ตัวอย่างจะอยู่ในแต่ละ compartment และได้ sensitivity ที่ดีที่สุด ซึ่งในตอนแรกเอนไซม์ที่ใช้ในแต่ละปฎิกิริยาจะถูก freeze-dry เอาไว้และเวลาจะใช้งานก็ให้คนใส่หน้ากากกดปุ่มให้น้ำจากถังเล็กๆ ไหลออกมากระตุ้นให้เอนไซม์ทำงาน เวลาอ่านผลก็เอาตัวแถบไปต่อกับหน้ากาก เขาเคลมว่าจะอ่านผลได้ภายใน 90 นาที [12]
ส่วนประกอบในหน้ากากตรวจโควิด ที่มา: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34183860/
อ่านเพิ่มเติม
- 8
โฆษณา
- ดาวน์โหลดแอปพลิเคชัน
- © 2026 Blockdit
